Miles Morales (Stimme im Original: Shameik Moore) wächst im New Yorker Stadtteil Brooklyn unter der Obhut seines Vaters Jefferson Davis (Bryan Tyree Henry) und seiner Mutter Rio Morales (Luna Lauren Velez) auf. Als Miles an eine neue Schule wechselt, hat er nicht nur mit dem hohen Arbeitspensum zu kämpfen, sondern wird auch noch dazu von einer radioaktiven Spinne gebissen und entwickelt übermenschliche Fähigkeiten. Während sich der Teenager mit seinen neu gewonnen Kräften zu arrangieren versucht, trifft er eines Tages zufällig auf Peter Parker alias Spider-Man (Chris Pine), der beim Versuch, den Kingpin (Liev Schreiber) davon abzuhalten, ein interdimensionales Portal zu öffnen, sein Leben lässt. Kurze Zeit später lernt Miles dann noch einen weiteren Spider-Man kennen, worüber er sich verständlicherweise wundert. Doch wie sich herausstellt, stammt Peter B. Parker (Jake Johnson) aus einer anderen Dimension und ist hier gestrandet. Und er ist nicht der einzige…